Keď v auguste 1526 v bitke pri Moháči Turci porazili spojenecké uhorsko-české vojská, Trnava sa ocitla v ohrození. Možno aj pre obnovené hradby Turci na Trnavu nezaútočili, hoci mesto na rovine mohli ich nájazdy ohroziť. Niektoré dôležité obchodné centrá v Uhorsku však Turci obsadili, preto význam Trnavy ako pohraničného obchodného centra vzrástol. V tomto období začali niektoré mestá v Uhorsku upadať, avšak počet obyvateľov Trnavy stále rástol. Základom obchodu Trnavy bol najmä trh s dobytkom. V Trnave sa okrem obchodu rozvíjali aj remeslá. Zvýšil sa aj počet trnavských jarmokov. Z predaja vína plynuli do mestskej pokladnice veľké zisky, pretože víno sa vo veľkom exportovalo za hranice Uhorska. Najviac vinohradov bolo v Suchej nad Parnou a Dolných a Horných Orešanoch. Mesto v roku 1564 kúpilo pivovar a pivo dodávalo aj do poddanských dedín. V roku 1574 začali stavať mestskú vežu, ktorá plnila funkciu pozorovateľne. Trnava sa v 16. storočí stala spolu s Bratislavou najvýznamnejším mestom Uhorska. Bratislava prebrala funkciu správneho centra a Trnava úlohu cirkevného centra. V roku 1543 sa do mesta presťahoval ostrihomský arcibiskup a Trnava sa stala na takmer 300 rokov sídlom ostrihomského arcibiskupa a kapituly. Mesto začalo plniť úlohu dôležitého náboženského centra, podľa čoho dostalo aj pomenovanie „Malý Rím“. Obdobím najväčšieho ekonomického rozvoja Trnavy bola posledná tretina 16. storočia. Mesto ako významné stredisko poľnohospodárskej, vinohradníckej a remeselníckej produkcie a vnútorného i zahraničného obchodu prosperovalo. Morové epidémie v rokoch 1562 a 1586 či požiar v roku 1566 síce spôsobili prechodné zníženie počtu obyvateľov i väčšiu chudobu, napriek tomu však mesto neupadalo. Obdobie 17. storočia sa vo všeobecnosti považuje za jedno z najhorších období v slovenských dejinách, pretože ho okrem vojen poznačili aj požiare, morové epidémie a náboženské nepokoje. Nechce sa ani veriť, že v tom čase sa Trnava stala prominentným kultúrnym centrom Uhorska. V roku 1635 v meste založili univerzitu spočiatku s filozofickou a teologickou fakultou, neskôr aj s právnickou a lekárskou fakultou. Jej zakladateľ, kardinál Peter Pázmány si želal, aby univerzita slúžila všetkým národnostiam žijúcim v Uhorsku. K univerzite patrila aj tlačiareň (najväčšia uhorská tlačiareň 17. storočia), ďalej archív, knižnica, zbierky, botanická záhrada, lekáreň, bohatá zbierka hudobnín a astronomické a meteorologické observatórium. Druhá polovica 17. storočia bola pre Trnavu tragická. V roku 1666 v meste vypukol požiar, ktorý ho takmer celé zničil. Neskôr však prišla ešte ničivejšia pohroma. Dátum 8. august 1683 si Trnavčania pamätali veľmi dlho, pretože v tento deň mesto zničil obrovský požiar. Vo vnútri mesta a pod hradbami zahynulo pravdepodobne viac ako 4 000 ľudí. Ďalšie nešťastia čakali na obyvateľov mesta na začiatku 18. storočia. V roku 1703 mesto obsadili kurucké vojská Františka II. Rákócziho. O rok neskôr sa niekoľkohodinový boj kuruckých a cisárskych vojsk, ktorý je z histórie známy aj ako trnavská bitka, skončil v prospech cisárskych vojakov. Počas vojnových udalostí mesto utrpelo veľké škody a naviac ho v roku 1710 postihla veľká morová epidémia, ktorá si vyžiadala takmer 800 ľudí. Postupne sa však pre Trnavu začalo obdobie rozkvetu a prosperity, keď počet obyvateľov rýchlo rástol. V roku 1720 v meste žilo 2 857 obyvateľov, v roku 1785 ich počet vzrástol na 5 179. V Trnave vydláždili námestie a najdôležitejšie ulice a mesto získalo nový vzhľad, ktorý vo veľkej miere poznáme dodnes. Trnava v 18. storočí dosiahla aj svoj kultúrny vrchol, keďže v tom období bola jediným univerzitným mestom v Uhorsku. Postupne však silneli hlasy volajúce po presťahovaní univerzity, ktorá pôsobenie v Trnave skončila v roku 1777. Aj keď univerzita v meste skončila svoju činnosť, je jasné, že sa veľkou mierou pričinila o rozvoj vzdelanosti v Uhorsku.