Als im August 1526 in der Schlacht bei Mohács die Truppen des Osmanischen Reichs die alliierten ungarisch-böhmischen Truppen niedergeschlagen haben, befand sich Trnava in Gefahr. Die Osmanen griffen Trnava vielleicht auch wegen erneuten Stadtbefestigungen nicht an, obwohl ihre Überfälle die Stadt hätten gefährden können. Einige wichtigen Handelszentren Königreichs Ungarn wurden aber von den Osmanen besetzt, deswegen vergrößerte sich die Bedeutung von Trnava im Sinne Grenzhandelszentrums. In dieser Periode fingen manche Städte im Königreich Ungarn an in Verfall zu geraten, während die Anzahl der Bewohner Trnavas ständig stieg. Das Kernstück Handels in Trnava war vor allem der Viehmarkt. Außer Handel entwickelten sich in Trnava auch Handwerke. Auch die Anzahl der Jahrmärkte stieg. Geld, das durch Verkauf des Weins gewonnen wurde, stellte auch beträchtliche Profite für die Geldkasse der Stadt dar, weil der Wein in großen Mengen ins Ausland exportiert wurde. Die meisten Weinberge befanden sich in Suchá nad Parnou, Dolné Orešany und Horné Orešany. Die Stadt kaufte im Jahre 1564 eine Bierbrauerei und lieferte Bier an untergebene Dörfer. Im Jahre 1574 fingen sie an einen Turm zu bauen, der als Beobachtungsstelle diente. Im 16. Jahrhundert waren Trnava zusammen mit Bratislava die wichtigsten Städte Königreichs Ungarn. Bratislava nahm die Funktion des Verwaltungszentrums über und Trnava die des kirchlichen Zentrums. Im Jahre 1543 zog der esztergomische Erzbischof in die Stadt um und Trnava wurde in den nächsten 300 Jahren die Siedlung des esztergomischen Erzbischofs und der Domkapitel. Die Stadt spielte auch die Rolle des religiösen Zentrums, nach dem sie auch „kleine Rom” benannt wurde. Das letzte Drittel des 16. Jahrhunderts war die Periode der größten ökonomischen Entwicklung von Trnava. Die Stadt prosperierte als wichtige Zentralstelle der landwirtschaftlichen, weinbauerischen und handwerklichen Produktion und als ein Zentrum des in- und ausländischen Handels. Wiewohl die Pestepidemien in Jahren 1562 und 1586 sowie auch der Brand im Jahre 1566 verursachten temporale Senkung der Einwohnerzahl und größere Armut, die Stadt verelendete nicht. 17. Jahrhundert wird allgemein als die schwerste Etappe slowakischer Geschichte beschrieben. Sie wurde nicht nur von Kriegen, sondern auch von Brände, Pestepidemien, und religiösen Konflikte betroffen. Man ist kaum zu glauben, dass gerade in dieser Zeit Trnava das prominente kulturelle Zentrum Königreichs Ungarn war. Im Jahre 1635 wurde in der Stadt eine Universität mit einer philosophischen und theologischen Fakultät gegründet, später kam auch juristische und medizinische Fakultät hinzu. Ihr Begründer, Kardinal Peter Pázmány wünschte sich, dass die Universität allen Nationalitäten Königreichs Ungarn diente. Zu der Universität gehörte auch Druckerei (die größte Druckerei Königreichs im 17. Jahrhundert), Archiv, Bibliothek, botanischer Garten, Apotheke, reiche Sammlung Musikalien und astronomisches und meteorologisches Observatorium. Die zweite Hälfte 17. Jahrhunderts war für Trnava leider tragisch. Im Jahre 1666 brach in der Stadt einen Brand aus, der sie fast zerstörte. Später aber kam eine noch verheerendere Katastrophe. Ans Datum 8. August 1683 erinnerten sich die Bewohner Trnava noch lange, weil an diesem Tag die Stadt durch den Brand zerstört wurde. In der Stadt und unter den Stadtbefestigungen kamen mehr als 4 000 Menschen ums Leben. Andere Unglücke ließen auf sich bis 18. Jahrhundert warten. Im Jahre 1703 wurde die Stadt von Franz II. Rákóczi und seiner Kuruzen-Armee besetzt. Ein Jahr später spielte sich zwischen den Kuruzen und den kaiserlichen Truppen eine ein paar Stunden dauernde Schlacht ab, die sogenannte Schlacht bei Trnava, die mit dem Sieg der kaiserlichen Truppen endete. Verschiedene Vorkommnisse im Verlauf der Kriegen geschädigten die Stadt im massiven Ausmaß, obendrein befiel die Stadt im Jahre 1710 auch eine Pestepidemie, die damals ungefähr 800 Opfer forderte. Schrittweise b